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      1. 新聞檢索

        血培養技術診斷菌血癥的最新進展與質量控制

        2020/11/4 14:37:17

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        作者:胡云建
        單位:國家衛健委北京醫院檢驗科


        摘要


        血流感染是指病原菌入侵血循環進行繁殖導致嚴重后果的疾病。而血培養高度敏感,易于操作,是目前確定血液感染病因的主要方法。本文主要闡述血培養技術的發展,包括自動培養儀的研發,培養基成分的調整。同時對于存在的高污染率的預防和滯后的菌種鑒定手段等問題進行了闡述,并從目前普遍使用的方法,包括規范取樣技術,引進計算機先進算法,利用分子檢測手段降低標本的污染率和降低人為判斷失誤,加強菌種的鑒定能力及質量指標幾個方面重點進行探討,提出污染預防和診斷手段提高的重要性。

        血流感染是指各種病原微生物侵入血循環,在血液中繁殖、釋放毒素和代謝產物,并誘導細胞因子的釋放,引起全身感染、中毒和全身炎癥反應,進而進一步引發血壓下降、導致凝血和纖溶系統的改變,從而引起全身多器官功能障礙,這是一種以高發病率和死亡率為特征的嚴重疾病[1],因此病原微生物的快速檢測十分關鍵。另外通過指導臨床醫生調整抗感染治療,可以避免無效治療,減少抗感染治療的范圍。比如限制耐藥菌株的選擇,以及限制選擇某些廣譜抗生素或聯合治療可能會對有益菌產生毒性和負面影響。再則,一般來說血液中的微生物含量比較低,可低至1-10CFU/ml,檢測的難度很大。所以找到血培養高度敏感,易于操作,迅速確定血液感染病因的方法一直是我們努力的方向。此外,含有豐富營養物質的標準瓶通常被用來進行血培養,從而檢測需氧菌和厭氧菌的生長。標準的培養時間一般是5天,可讓大部分微生物恢復活力,包括一些苛養菌。有時候也需要適當增加培養時間使生長較慢的微生物達到儀器自動報警的檢出限,比如真菌和分枝桿菌[2]等。為了提高血培養的檢測能力,研究人員從開發自動培養儀[3-5],調整培養基的成分[6, 7]來提升效率,通過規范采樣技術,引進計算機先進算法,利用分子檢測手段[8]來減低標本的污染率,去除人為的判斷,加強菌種的鑒定能力。


        血培養最新進展


        1. 血培養儀器:血培養方法經歷從手工、半自動(放射性)、侵入性半自動、非侵入性全自動、高度全自動的發展歷程。傳統手工法是將血液標本置于增菌肉湯中孵育,肉眼判斷是否有細菌生長,頻率為每天1次,有生長跡象進行鏡檢和轉種,否則繼續孵育,一般為7天。手工檢測敏感度較低,受主觀因素的影響,且不能及時發現陽性標本。隨后人們逐漸把重點放到了自動化培養和檢測技術的升級中。現代化的實驗室一般依靠自動培養儀來監控病原微生物的生長情況。檢測原理一般基于病原微生物生長代謝產生的二氧化碳濃度變化來監控微生物的生長情況。早期的半自動血培養儀先后通過14C標記培養基,紅外線穿刺檢測等來實現,但因為放射性安全、“有創性”檢測引入外界污染等缺陷,血培養檢測效率依然較低[9]。1985年Dr. Thurman Thorpe及其團隊發明可以用于檢測細菌生長的內部檢測傳感器,提出“非侵入性”血培養檢測理念。1989年生物梅里埃公司(bioMérieux)開發了全球首臺BacT/ALERT 3D全自動培養儀,通過監測微生物代謝產生的二氧化碳引起含有標本的培養瓶的底部感應器發生的顏色變化(由灰變黃),隨之處理以圖像及聲音進行警示,Bact/ALERT與主服務器相連可使測試功能進一步自動化[9]。隨后美國BD公司研發的BACTEC™ FX血液自動培養儀利用了產生的二氧化碳導致熒光的變化來檢測微生物生長情況,其可遠程獲得的實時培養結果,從而提高臨床決策和實驗室工作流程。


        近年生物梅里埃公司推出的新一代VIRTUO全封閉自動化培養系統,與BacT/Alert 3D系統,BACTEC FX等上一代培養系統相比,整合上、下載、標簽掃碼等更多手工步驟為自動化運行,避免因為頻繁開合箱體引起的培養溫度波動。VIRTUO的全封閉式箱體可維持恒定培養溫度(35-37℃),更有利于促進微生物的生長。同時Virtuo改進傳統斜率算法為RAUC(曲線下面積)、R2R(讀數讀取變化)和EI(早期讀數分析)三種算法結合,更快地檢測微生物是否報陽。相比于3D系統[10-12]和BACTEC FX系統[13-16],可縮短20%檢測時間(time to detection)[17-18]。Miller N等比較VIRUTO與3D系統在8種常見病原體檢出時間差異,VIRTUO檢測需氧和兼性厭氧微生物的時間明顯縮短,平均減少約3小時,脆弱擬桿菌TTD差異最大,中位改善為46.7小時[11]。Liottie FM等針對BACTEC FX,3D和VIRTUO系統的評價發現,按菌種區分VIRTUO至少可節省2小時報陽時間。同時因為VIRTUO獨有的自動上、下載功能,比較血培養瓶操作過程BACTEC FX系統需要11步,而VIRTUO僅需1步,大大節省血培養手工操作[19]。


        2. 血培養瓶成分的研究進展:在自動培養儀發展的基礎上,調整培養基成分也是提高感染病原微生物的檢出效率的重要因素。已經接受抗生素治療的病人血液標本中會含有抗生素,導致血培養過程中病原菌生長速度緩慢,錯過最佳的抗感染治療調整時機。培養基中加入活性碳或樹脂可以幫助中和取樣前的抗生素,從而幫助更快的檢測到微生物的復蘇[20]。活性碳血培養瓶以生物梅里埃生產的BacT Alert FAN為代表。根據文獻報道活性碳瓶相比于未添加抗生素中和劑的標準血培養瓶能提高陽性率[6, 7]。盡管在檢測時間上活性碳瓶和標準瓶沒有明顯差異,但是在金黃色葡萄球菌、凝固酶陰性葡萄球菌、酵母菌等的檢出率上,活性碳瓶有明顯優勢[7]。


        樹脂血培養瓶以美國BD公司生產的BACTEC Aerobic/F Plus和生物梅里埃近年新上市的BacT/ALERT FAN Plus為主要代表。其中BacT/ALERT FAN Plus還添加能夠吸附碳青酶烯類抗生素的專利化學吸附劑[21]。樹脂瓶顯示比活性碳瓶更佳的病原菌檢出性能和更短的報陽時間,其中在1507例需氧瓶和2386例厭氧瓶對比試驗中,BacT/ALERT FA plus和FN plus均顯著提高金黃色葡萄球菌和總微生物的生長恢復,相比活性碳瓶檢出時間縮短2-2.4小時[22]。Chen IH等利用體外模擬驗證不同品牌樹脂瓶生長性能發現,BacT/Alert FA plus與Bactec Aerobic/F Plus瓶接種抗生素與銅綠假單胞菌檢測時間相似,而在大腸桿菌和肺炎克雷伯菌中BacT/Alert FA plus培養時間更短。BacT/ALERT FN plus瓶比BACTEC Anaerobic/F Plus瓶在美羅培南和亞胺培南回收上有更好效果,整體恢復率更高[23, 24]。Lovern D等利用反相高效液相色譜評價不同樹脂血培養瓶中的抗生素結合及細菌生長動力學研究顯示,BacT/ALERT FA PLUS針對β-內酰胺類抗生素,喹諾酮類,達托霉素,頭孢洛林等吸附速率顯著優于BACTEC Anaerobic/F Plus[25]。Fiori B等開展1032套血培養前瞻性臨床比對發現,BacT/ALERT FAN plus相比BACTEC Plus樹脂瓶,對陽性球菌、陰性菌檢出率更高,整體報陽時間無顯著性差異,但對于治療失敗(經驗性治療無法覆蓋病原體)的血培養組,BacT/ALERT FAN plus瓶的檢出時間更短[26]。


        3. 病原菌的分離和鑒定:確定陽性血液標本之后進行病原菌的鑒定對后續有針對性的治療也十分關鍵。目前的鑒定方法可以分為以下幾種,亞培養獲取純菌落,新型的陽性血樣的分子檢測法。


        (1)亞培養獲取純菌落:可以進行短時間的亞培養來獲得純菌落,從而進行傳統的生化檢測,包括基質輔助激光解吸/電離飛行時間質量光譜法(MALDI-TOFMS),PCR和基因測序。


        (2)新型的分子檢測法:核酸擴增法是最常用的鑒定病原體的方法。多聚PCR使用通用引物靶向細菌(16S)或真菌(18S)基因組的保守rDNA區域,隨后通過測序屬/種特異性實時PCR檢測對微生物進行鑒定,比如膿毒癥流芯片(Master Diagnostica)和ePlex®。原位雜交法利用兩個互補核酸鏈的特異性結合,其中一個探針是已知的核酸序列,另一個是未知微生物基因組的一部分。特異性的結合可以被熒光顯微鏡捕捉到,包括PNA-FISH®,QuickFISH®,AccuProbe®,Accelerate PhenoTM等。DNA微陣列雜交法由固定在固體表面的短寡核苷酸組成,同時、并行地檢測許多病原體及其抗菌素耐藥基因。DNA微陣列所覆蓋的物種一般約占已知引起血流感染的病原體的90-95%,其敏感性在10^1-10^5細胞/mL之間[8]。


        4. 血培養瓶報陽后的直接藥敏試驗:血培養瓶報陽后,由于不能對血培養瓶中細菌數量按藥物敏感性試驗要求進行標準化,其次用來檢測的少量血液混合物樣本可能含附加劑(如血液中的抗菌藥物、抗凝劑和其他附加劑)等因素影響,一般不建議做直接藥敏實驗,盡管該方法可減少結果報告所需的時間。近年來,血培養瓶報陽后,直接快速的抗菌藥物敏感性試驗有了如下進展:


        (1)EUCAST:于2018年11月28日發布陽性血培養快速藥敏方法(RAST),包含了短時間培養方法及抑菌圈直徑折點表用于判定結果,于2019年05月02日進行了修訂。其操作方法:當血培養報陽后,報陽后0-18小時后的血培養瓶適用于此方法,在進行測試前無需提前從血培養儀中取出血培養瓶,從血培養瓶中直接取:125±25μL,可使用3方向擦拭涂布的標準方法或平板旋轉器進行接種并涂布MH平板完成藥敏接種,并貼上抗菌藥物紙片,35℃培養。在孵育4,6,8小時后分別讀取藥敏結果,不同的孵育時間有相應的折點和結果解釋標準,從培養基正面量取抑菌圈直徑。需要注意事項:可直接使用血培養陽性瓶中的液體進行接種,無需離心或稀釋;目前適用的血培養瓶包括(BACTEC,Bact/ALERT和Thermo);只有存在明顯抑菌圈邊緣時,才能量取,否則需要延長孵育時間;平板孵育及判讀時間不應超過8小時;使用血培養報陽后直接藥敏測試(RAST)的折點而非常規EUCAST細菌耐藥折點。在進行結果解釋時,需要進行鑒定,根據鑒定結果選擇合適的表格進行結果解釋。目前只有大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌和屎腸球菌有結果解釋標準:也就是說折點僅適用于規定的菌種和孵育時間,不適用于表中未包括的菌種和/或孵育時間,同時確保質控結果在控。


        (2)Accelerate Pheno檢測系統:2017年2月,FDA批準Accelerate Diagnostics公司銷售Accelerate Pheno system和Accelerate PhenoTest BC (血培養)試劑盒,用于從陽性血培養標本中直接鑒定14種常見病原菌和AST,以及直接鑒定兩種念珠菌(僅用于鑒定)。Accelerate PhenoTest BC試劑盒,包括48個流動池通道,可裝載5ml陽性培養液。每個盒子內包含兩個凝膠電泳站和熒光原位雜交探針(用于鑒定)、抗菌藥物和其他必需的試劑(用于自動標本制備、對目標細菌和真菌進行鑒定以及對目標細菌做AST)。對于每個標本來說,Accelerate PhenoTest BC試劑盒加載的總勞動時間小于10分鐘。用形態動力學(細胞形態學、質量、分裂速率、異質性、細胞的異常生長模式和微菌落)細胞分析方法作為時間推移圖像來分析子代克隆,圖像分析軟件生成生長概率評分以及MICs基于祖細胞向子代細胞克隆生長速率。儀器通過使用軟件從測量參數中計算出MIC值,并應用基于2016 CLSI和FDA折點的專家規則。應將檢測結果結合革蘭染色結果一起解釋。Charnot-Katsikas等人在臨床微生物實驗室內通過連續對232瓶新鮮陽性血液培養中的241株病原菌(223瓶為單一病原菌和9瓶多個病原菌)進行檢測來評價。在抗菌藥物敏感性檢測方面,與常規方法相比,總的基本一致率為95.1%,分類一致性為95.5%。與標準流程相比,Accelerate Pheno system對病原菌鑒定的時間和AST的時間分別減少了23.47h和41.86h[27]。


        血培養的質量控制


        1. 污染率:研究報道的最多的血培養質量指標是污染率。一般建議血培養的污染率應保持在或低于 3%。血液標本污染會造成培養結果的假陽性,從而導致嚴重的后果。因此降低污染率會提高血培養檢測的特異性,為隨后的治療提供更好的保障。目前已經被確認可降低污染的步驟包括皮膚消毒準備工作、培養瓶的消毒、瓶接種使用單針和雙針、使用專門的抽血小組,使用商業血液培養采集試劑盒等。由于皮膚通常被認為是最可能污染血樣的來源,所以可采用聚乙烯吡咯酮碘,碘酒,含酒精的產品作為皮膚消毒的主要物質。但是即使采用皮膚消毒也是不能絕對完全防止皮膚菌群對于血液培養的污染,因為檢測到多達20%的皮膚相關細菌可在消毒后仍具有存活能力。大量的歷史數據顯示皮膚消毒劑并不像氯己定一樣有效。使用氯己定需要進行培訓, 以實現有效的皮膚消毒, 另外采用雙針,即丟棄用于抽取血液培養物的針,使用新的針來進行接種被認為是可以減低污染率[28]的有效方法。


        既然無法完全消除標本污染的概率,那么鑒定假陽性和菌血癥成了另一個挑戰。臨床醫生通常采用以下方法進行鑒別:1)菌種鑒定。常規上金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌等腸桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌等通常被認為是導致菌血癥或真菌血癥的菌種。而凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌種類、炭疽桿菌以外的芽孢桿菌種類、痘丙酸桿菌、微球菌種類、綠藻群鏈球菌、腸球菌和產氣莢膜梭狀芽孢桿菌等則通常被認為是污染菌。2)陽性血培養的套數。多套陽性培養瓶長出了同一個菌種,說明是菌血癥。但是如果僅一套培養長出了通常被認為是污染源的菌種,則被認為是假陽性。3)在一套血培養中的陽性瓶數。僅一個培養瓶長出微生物,說明假陽性的概率很高。4)培養時間。菌血癥組的菌量通常比污染組的大,所以真陽性組的培養時間通常較短。5)數據分類技術的引進。感染控制活動是高度數據密集的,衛生保健信息技術為改進監測和報告系統的效率提供了巨大的潛力。針對血液培養污染的挑戰,研究人員已經探索了采用自動的、基于計算機的算法對培養結果進行分類,從而辨別可能的污染物或病原體。在大量的血培養數據基礎上,結合病人的生命體征和用藥數據來建立預測模型,其準確度通常可以達到,甚至超過感染控制人員的判斷水平。這種方法至少有兩個潛在的好處:在面對不明確的培養結果時協助臨床解釋和決策,以及為醫院感染和血流感染率的監測提供客觀的、可重復的、成本效益高的方法[28]。


        2. 采血量:采血量是決定血培養檢出率關鍵變量[29],對于檢測膿毒癥的病原菌來說,抽足量的血標本比抽血時間更重要。Donnino MW等研究發現多數血培養瓶采血量一般低于指南推薦[30]。采血量過少會影響陽性檢出率,過多血細胞的呼吸作用會造成假陽性等。目前,三甲評審檢查內容分類匯總(檢驗科),除查危急值報告制度和流程(血培養危機值回報)外,還查標本驗收標準(血量檢查);CNAS CL02醫學實驗室質量和能力認可準則中,原始標本采集的類型和量要求實驗室應定期評審靜脈穿刺取血(及取其他標本如腦脊液)所需的標本量,以保證采樣量符合要求;CAP認證要求除血培養污染率外,也要求血量檢測。


        血培養瓶中有足夠的采血量,如果采血量不在規定的范圍內, 應告知送檢醫生和護士, 并建議重新采集血培養。常用評估采血量有肉眼觀察法及稱重法。盡管肉眼觀察操作起來很容易, 但因培養瓶的壁厚、人主觀判斷等因素, 因此該方法有一定誤差。相比之下, 稱重和與已知標準比較重量更為客觀。目前自動化血培養系統可提供的血量監測技術包括BACT FX系統通過Epicenter中間件利用血細胞代謝批量(25瓶/批)間接測量血容量[31],VIRTUO則通過直接液面測量實時監測單瓶采血容量[17]。VITRO還可以對不同科室的采血量進行統計,此數據對護士規范化采血培訓很有幫助。


        3. 血培養的套數:另一項常用的質量評估指標是每次敗血癥期采集血培養的套數。采集的套數應該遵循我國衛生行業標準2019年發布《臨床微生物檢驗標本的采集和轉運》。如果已在抗菌藥物治療之前抽取了多套血培養,當患者使用抗菌藥物后還是同樣高熱發作時不建議再作血培養,因為再做的血培養罕見有陽性結果。血培養真正的陽性率應該在6-12%范圍內,如果過低,可能同一患者送檢血培養次數過多,陽性率過高,則說明送檢的血培養數量多于推薦量,不符合血培養送檢要求。


        結 論


        血流感染是一種高發病率,高死亡率的疾病。血培養具有多種臨床作用——預后、指導治療、監測療效、流行病學分析,在短期內,任何新技術都不可能完全取代血培養。目前普遍使用的自動培養儀進行血培養的方法,在儀器自動化功能,血培養瓶成分改進方面均有較大的發展,極大程度優化傳統血培養流程,提高了檢測效率。但依然存在標本污染現象,導致一定假陽性率。在加強質量控制的基礎上,使用先進的分子鑒定技術和以計算機為基礎的大數據分析手段為未來實現快速和高效的診斷提供發展方向。新技術和血培養正被整合成為一種檢測策略,且兩者都能發揮各自的優勢。


        參考文獻略


        注:本文來源于《臨床實驗室》雜志2020年第10期“感染性疾病”專題




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